Fluorescencja

[planapo]

jestem bardzo ciekaw finalu (:

ciekawe jak potem pojdzie z dokumentacja bo FL pod tym wzgledem jest niestety dosc wredna.

[wiedzmin]

Johny, myślę nad tym projektem który chciałeś do mikroskopu konfolalnego. Rozumiem że potrzebujesz system który pozwoli na omiatanie preparatu wiązką lasera z tym że wytłumacz mi dokładnie jak to ma wyglądać. stolik ma być wirujący a posuw wiązki lasera promienisty w jednej płaszczyźnie czy chcesz żeby stolik nie wirował laser był nieruchomy a stolik linia po lini naprowadzał preparat na laser? W sumie obracający sie stolik to nie problem i skanujący laser od środka preparatu do zewnatrz to dosyc latwe do zrobienia, ale skanujący laser linia po linii to już wymaga wiecej zachodu

[phacops]

JohnyM
Co do filtrów polecam NRD panchromary
Mają 2 takie IR
1 słabszy od 720 zapewne 680-690?
Po kowersji wygląda tak

2 mocniejszy 750 jeśli nie więcej możliwe że nawet 850
Po konwersji wygląda tak

Porównanie z 720
Po konwersji.

[Pickul]

JohnyM życzę powodzenia i wytrwałości

[JohnyM]

[at]: chodzi o filtr typu cut-on - czyli blokujący IR i daleką czerwień, te są typu short/long pass, a ja potrzebuję raczej bandpass.
[at]: na razie konfokal jest gdzieś między fantasy a science-fiction ale myślałem raczej o wirującej tarczy + program do stolika, który sam przeleci cały preparat w wyznaczonych granicach x-y-z. Ale to przewiduję najwcześniej za rok.

Na razie mam dość zaawansowane postępy w fluorescencji i lampie błyskowej do biolara. I to chcę dociągnąć do końca.
[at]: Dziękuję bardzo.
[at]: z dokumentacją jest różnie, ale generalnie to aparat widzi więcej niż oko. Tu przykładowe dwa zdjęcia: Pierwsze to bebechy z trzykrotki w ciemnym polu. Wzbudzanie BV. Drugie to fluorescencja BV + DIC (zielona + czerwona) przy miss-matchu filtrów barierowych (są kolorowe, czyli wprowadzają zmianę do obserwowanej barwy, zostały tak dobrane, że pole widzenia zamiast niebiesko-fioletowego [bez filtra] lub czarnego [z prawidłowym filtrem] stało się mniej więcej białe i można było ustawić ładnego DICa [przy monochromatycznym nie wygląda on jakoś specjalnie]).
Jak zwykle zdjęcia nie powalają jakością, robione moimi trzęsącymi rękoma z komórki. W okularach wygląda to naprawdę ładnie.
Dobra wiadomość, zbliża się nieubłaganie zakup lustrzanki, poszukuję odpowiedniego sprzętu

[Pickul]

Jeżeli możesz połączyć fluo z DIC, to rozumiem że budujesz epi fluorescencję ?
Czy można też łączyć techniki przy dia fluo ?

[planapo]

gratulacje i powodzenia, milo patrzec na tak zaawansowane przerobki jak skonczysz to pokaz tez zdjecia sprzetu (:

[phacops]

Pomyśl więc nad Pentaxem

[planapo]

albo Canonem 600D lub wyzszym - znaczna wiekszosc swiatowych wyjadaczy w mikrofoto go uzywa.

[JohnyM]

Można przy dia. Pzo robiło KFFL, choć dla BV to co widać w okularach nie było wcale piękne (jakby kontrast fazowy z niebieskim filtrem interferencyjnym + barwy fluorescencyjne). Przy EPI też jest bardzo trudno połączyć.
Generalnie dla wzbudzania światłem UV jest to proste, bo filtr barierowy jest bezbarwny - efekt to normalny dic/kf z fluorescencją. Dla dia i epi.
Dla światła V, BV, B itd. filtr barierowy jest od barwy zielonkawo-zółtej, żółtej, rdzawej i przesuwa się w stronę mocnej czerwieni. Efekt jest taki, że zmienia się barwa światła (i fluorescencyjnego i z oświetlacza techniki wspomagającej). Czyli obserwujemy zamiast szarego tła DICa tło w barwie filtra barierowego - i tu w przypadku kostek olympusa/nikona/zeissa/leica nie ma na to rady.
W przypadku moich filtrów można zamiast idealnego filtra barierowego (dającego czarne tło) zastosować mieszankę filtrów barierowych przepuszczających światło wzbudzające. Na tyle je osłabiają (w okularach, bo ilość wzbudzająca fluorescencję jest taka sama), że fluorescencja staje się widoczna i na tyle przesuwają długość fali, że światło fioletowo-niebieskie po ich przejściu staje się białe - i możemy zrobić ładnego DICa.
Na razie udało mi się to tylko dla światła BV. Jak dostanę odpowiedni metalohalogen do UV to będzie można łączyć DIC z UV, V i BV w systemie DIA i EPI.
Nie jest to proste i efekt będzie inny dla halogenu, inny dla żarówki, inny dla LEDa itd. Z tego się cieszę, że mój koncept daje pełną swobodę działania, a kostki są bardzo ukierunkowane.

Co do aparatu, to myślałem nad czymś w rodzaju canon 550, 600 lub 1100, korzystam z tej stronki jako poradnika:
lmscope.com/produkt22/Camera_Ranking_en.shtml

[JohnyM]

Informacyjnie: Dla mikroskopu biolar nie są wymagane żadne przeróbki do adaptacji filtrów


W związku z pytaniami jakie do mnie spływają postaram się stworzyć taki mini-poradnik do mikroskopii fluorescencyjnej.

UV - ultrafiole 350 -400nm, V - fiolet 380-450nm, BV - niebieskofioletowe 400-500nm, B - niebieskie 450-500nm, G - zielone 500-550nm, Y - żółte 550-600nm, O/R - pomarańczowy, czerwony 600nm-680nm, DR - daleka czerwień 680 - 750, IR - podczerwień 750nm+ .
Dla autofluorescencji, najlepsze jest światło bliższe do UV, także V, B i G. Rzadko pozostałe.
Do wszystkich typów fluorescencji jest mnóstwo fluorochromów - są znacznie wydajniejsze od autofluorescencji i wysoce specyficzne.
Światło DR jest używane do wzbudzania fluorochromów IR - widocznych tylko dla specjalistycznych kamer, dla oka niewidoczne - do zaawansowanych badań.
Najbardziej użyteczne dla amatora jest w kolejności malejącej: UV, V, B, i na koniec G.
"pik - na wykresie wydajności świetlnej wąska i wysoka krzywa.
"VIS - światło widzialne - około 380 - 750nm

Ogólnie o źródłach światła:
1. Żarówka halogenowa - Im więcej K i W tym lepiej - wzbudza wszystko od UV do IR. Mało UV - V - B. Dużo G - Y - O - R - DR - IR. Dla UV i V może się okazać zbyt słaba do wzbudzenia. Bardzo tania, łatwa i bezpieczna w obsłudze. Dla amatora najwygodniejsza, ale zarazem najmniej wydajne źródło światła. Koszt - kilka / kilkanaście złotych.
2. Metalohalogenowa zwykła - Trochę lepsza od halogenu - składa się z dwóch części. Zewnętrzna bańka jest zabezpieczeniem, jest pokryta filtrem UV. Niektóre mogą pracować ze zbitą bańką zewnętrzną - wtedy byłby to bardzo tani i uniwersalny oświetlacz do fluorescencji, także UV. Koszt paręnaście złotych.
Łatwa w zasilaniu, bardziej skomplikowana w obsłudze, niebezpieczna.
NIKOMU NIE POLECAM ZBIJANIA ZEWNĘTRZNEJ BAŃKI METALHALOGENU! PRACUJE ONA POD WYSOKIM CIŚNIENIEM I WYPROMIENIOWUJE DUŻO NIEWIDOCZNEGO ŚWIATŁA UV. PRZY ZŁYM DOBORZE FILTRÓW I NIEODPOWIEDNIM ZABEZPIECZENIU LAMPY MOŻE USZKODZIĆ WZROK, OPTYKĘ MIKROSKOPU I SPOWODOWAĆ OBRAŻENIA.
3. Metalohalogenowa specjalistyczna - skomplikowane zasilanie i operowanie, niebezpieczna. Najlepsze źródło promieniowania, długa żywotność i użyteczność w całym spektrum. Większa skuteczność w UV od HBO, identyczne piki jak HBO (odrobinę słabsze, za to wyższa wydajność na całej długości VIS). Koszt 150 - 100zł
4. XBO - Użyteczna w całym spektrum - coś pomiędzy halogenem a metalohalogenem / HBO. Piki pojawiają się dopiero w IR - dlatego są bezużyteczne a sam palnik emituje dużo ciepła. Skomplikowane zasilanie i operowanie, niebezpieczna. Koszt paruset złotych.
5. HBO - Najpopularniejszy palnik w fluorescencji. Skomplikowane zasilanie i operowanie, niebezpieczna. Około 100-250 godzin pracy (minimum 15 minut pracy w jednej sesji) Gorsza wersja metalohalogenu (choć dużo starsza, a co znane i lubiane.). Koszt 300-800zł.
6. Diody kolorowe - ostatni krzyk mody (np: zeiss colibri), każda dioda ma jedynie jeden wąski pik. Zaleta - nie potrzeba filtra wzbudzającego/ mniej światła wzbudzającego trafia do okularów. Wada - ograniczone możliwości wzbudzania wielu fluorochromów równocześnie (takie ładne 5-kolorowe fotki ). Problem częściowo wyeliminowany przez zeissa (pulsacyjna, naprzemienna praca wielu ledów). Skomplikowane w zasilaniu (nawet bardzo, bo większość ma swoje określone wymagania), bezpieczne i łatwe w operowaniu, SŁABE (wszystkie z powyższych źródeł światła są silniejsze, co nie oznacza, że LEdy nie dają rady). NAJDROŻSZE (no, poza laserem) ze wszystkich źródeł światła, a zarazem tanie. Jeśli ktoś będzie oświetlał tylko światłem niebieskim to od 30-300zł (w zależności od mocy i długości fali). Jeśli chcemy osiągnąć pełne spektrum, to będzie ich potrzeba 10-20sztuk - do tego ze 2-3 zasilacze (przy mojej nikłej wiedzy z elektroniki) + trzeba stworzyć system naśladujący colibri, lub co chwilę zmieniać oświetlacz.
7. Lasery - lepsza wersja Ledów Dużo mocniejsze, niestety trzeba ich jeszcze więcej niż ledów (piki nie są już pagórkami, tylko prostymi liniami). Niektóre są bardzo tanie (można użyć niektórych wskaźników) a niektóre obrzydliwie drogie. UWAGA: TANIE CHIŃCZYKI NIE MAJĄ FILTRÓW BARIEROWYCH! Czyli teoretycznie i przykładowo: laser który emituje 535nm, tak naprawdę powstaje z konwersji fali ir o długości ponad 1000nm do około 850nm a dopiero potem jest emisja owych 535nm. Część tych fali przedostaje się niezmieniona przez układ optyczny i mimo, ze ich nie widać, to możemy sobie nimi wypalić oczy!
TANI LASER MIMO ŻE TANI (sic!) I SKUTECZNY MOŻE USZKODZIĆ OPTYKĘ (w szczególności filtry) I OCZY! BEZ PEWNOŚCI ŻE TWOJE FILTRY BARIEROWE NIE WYCINAJĄ IR NIE UŻYWAJ LASERA DO BEZPOŚREDNIEJ OBSERWACJI OKIEM! MOCNE LASERY NAWET Z VIS, MOGĄ SPOWODOWAĆ USZKODZENIE TERMICZNE! NIGDY NIE UŻYWAJ LASERA JEŚLI TWOJE FILTRY BARIEROWE NIE WYCINAJĄ SKUTECZNIE JEGO EMITOWANEJ FALI.

Porównanie HBO i metalohalogenu z zeisscampus:

[Pickul]

Rzeczowy poradnik , gratuluje.
W związku z powyższym jako totalny amator zaczynam zabawę z fluorescencją od halogena. Dzięki.

[planapo]

bardzo dobrze napisane, wreszcie jasno, a nie takim jezykiem, ktory tylko tegie fizyczne glowy rozumieja. swietnie, poziom specjalistycznej wiedzy na forum rosnie (: