Fluorescencja

[JohnyM]

Problem jest taki, że używasz diody LED a oświetlacz był dostosowany do pracy z lampą (która też ma swoją optykę) HBO. Poszukaj teraz puszki z halogenem / hbo do tego oświetlacza.
Takiego typu mnogość barw można uzyskać bezproblemowo, bo praktycznie każdy paproch świeci i to w różnych kolorach. Właściwie to jest traktowane jako problem. Trudniej jest uzyskać wielobarwną emisję wartościową.

-

Połączenie (sprzętowe) fluorescencji z DIC na moich filtrach.
Fluorescencja chlorofili (czerwony), reszta to komórki i aparaty szparkowe gniecionego liścia trzykrotki.
Niestety w tych warunkach expsimulator w canonie nawalił [widział ciemność] i ekspozycję trzeba było ustawiać w ciemno, trochę przepalone nie wiem czy komputerowo można to poprawić.

[sebba28]

Johny M sprobowalem zmniejszyc przepalone miejsca za pomoca Shadows/Highlights w PS5 oraz przesunac troche color na czerwony w Color Balance.Nie wiem czy troche nie przesadzilem bo nie widzialem tego na zywo.

Tak sie zastanawiam czy nie opisywales kiedys fluorysccencji w swietle przechodzacym tu na forum?Jakos nie moge tego watku znalezc.(Czy mi sie tylko wydaje?)

[planapo]

znalazlem to:

A fluorescencja Dia jest bardzo prosta do wykonania bez specjalnych przeróbek. Filtr pod kondensor, filtr pod okular i gotowe. Gorzej z zabawą w epi, bo trzeba jeszcze dobrać odpowiednie dla obu filtrów lustro. Za to efekt bije na głowę wszelkie diki, kaefy i inne, choć wymaga dostępu do odczynników i trochę wiedzy.

FL w każdym, jakimkolwiek przypadku MOŻE bić DIC i cokolwiek innego na głowę. Konfokalnego mikroskopu nigdy nie widziałem na oczy, ale jest to dodatkowa przystawka w formie wielkiej skrzynki z kamerą (właśnie dla takich celów widuje się głowice na dwie kamery), która dodatkowo podkręca jakość obrazu fluorescencyjnego. Fluorescencja wymaga stosowania kilku różnych fluorochromów i wiedzy, który i co wybarwi". Nie da się wziąć kropli z kałuży i oglądać (choć same świecą chloroplasty ).
FL Dia, tak jak napisał Planapo, była produkowana do biolara, jest nawet jedna lampa na allegro ale w nieznanym stanie i nieciekawej cenie.
Dia wymaga mniej intensywnego światła (daje więcej światła wzbudzającego), ale wtedy filtr barierowy nie wyłapuje go całkowicie i spada kontrastowość między obiektem a tłem. Można je łączyć z DF/KF/DIC (DF eliminuje problem kontrastowości, KF uwidacznia pozostałe elementy, DIC wymaga bardzo dużo światła i rzadko jest używany). Filtry wzbudzające trzeba dobrać do użytego fluorochromu, źródła światła (bardzo mocny halogen daje radę, ale 100% efektywności tylko z bardzo drogimi palnikami HBO), umieszcza się je pod kondensorem. Do filtru wzbudzającego dobierany jest odpowiedni filtr zaporowy, umieszcza się go między mikroskopem a nasadką okularową podobnie jak analizator z UFC (i lampa z allegro przestaje być fajna ).
Epi działa w ten sam sposób, ale dodatkowo w kostce znajduje się jeszcze lustro dichroniczne dobrane do obu filtrów. Epi zdobyła popularność, szczerze mówiąc nie wiem dlaczego (tak dziwne jak to, że większość wybiera KF pozytywny nad negatywnym). Mikroskop TRZEBA obsługiwać w ciemni, o KF, DF, DIC można zapomnieć (niekoniecznie, ale poza zasięgiem śmiertelnika, ewentualnie gen McGywera).
Kilka razy próbowałem dostać wybrakowane kostki na ebayu (choć do tej pory mi się nie poszczęściło i zawsze o kilka funtów pod koniec mnie przelicytują), bez lustra, albo same filtry za około 10funtów, i to właściwie wszystko co jest potrzebne do DIA.

Bardzo nieliczne obiekty wykazują fluorescencję tak jak np: chlorofil czy olejek immersyjny (dlatego do FL jest używany specjalny). Podobnie jak w mikroskopii świetlnej stosuje się barwniki dla uwidocznienia struktur, tak w FL stosuje się fluorochromy. Fluorochromy to substancje, które łączą się z określonymi strukturami i wykazują zdolność do fluorescencji. W uproszczeniu: Fluorescencja jest bardzo słaba, i w jasnym polu niedostrzegalna. Dlatego przy pomocy filtra wzbudzającego wycinane jest całe pasmo świetlne za wyjątkiem tego które fluorescencję pobudza (filtr umieszczony pod kondensorem). Następnie niezbędny jest filtr barierowy, umieszczony za preparatem (im mniej szkła przed filtrem tym lepiej - szkło optyczne często wykazuje fluorescencję, dlatego stosowane są specjalne obiektywy - na zwykłych poprostu jest trochę gorszy obraz), który wycina wiązkę światła wzbudzającego.
Czyli np. (przykład wyssany z palca, ale obrazuje o co chodzi):
Żarówka emituje wiązkę 350-650nm która pada na filtr wzbudzający. Po przejściu przez filtr zostaje wiązka 420-480nm, która pobudza obiekt do fluorescencji- wysyła on światło o długości 600nm. Następnie na filtr barierowy padają dwie wiązki: 420-480nm i 600nm, ale filtr barierowy przepuści tylko 600nm, bo wycina pozostałe. W efekcie mamy czarne tło (im ciemniejsze tym lepsza jakość filtrów FL, czasem stosuje się ciemne pole dla dodatkowego podniesienia kontrastu) i jasno świecący obiekt.
Każdy fluorochrom jest pobudzony przez określoną długość wiązki, dlatego należy dobrać odpowiedni filtr wzbudzający (wysoce specyficzny) oraz barierowy (bardziej uniwersalny). W Epifluorescencji dochodzi jeszcze lustro dichroniczne, które jest specyficzne dla filtra wzbudzającego i barierowego (po części samo działa jak filtr), dlatego jego dobór jest krytyczny dla obserwacji.
To tak w uproszczeniu

Co do FL: Jeśli masz dobry komplet filtrów to właściwie nie ma jasnego pola", bo tło jest wygaszone. W FL DF to jeszcze ciemniejsze pole . Jeśli obiekt nie wykazuje naturalnej fluorescencji, to bez fluorochromów (barwniki specjalistyczne - musisz wiedzieć co masz na szkiełku, nie wystarczy nałożyć kroplę z kałuży) prawie nic nie zobaczysz.
Lampa rtęciowa nie jest potrzebna, ale popularna ze względu na swoją moc. Często używane są też halogeny i specjalne LEDy. Generalnie chodzi o moc, im większa tym lepszy obraz, im słabsza, tym trudniej go uchwycić wzrokiem. Dlatego mikroskopy FL ustawia się w ciemnych pomieszczeniach. Bardzo duże znaczenie ma tutaj kolektor i wypełnienie światłem.
Generalnie, FL to raczej specjalistyczna technika, jeśli ktoś pyta o takie rzeczy (proszę nie odbierać jako atak ), to raczej nie osiągnie przez dłuższy czas jakichkolwiek efektów.

Zgaduję, że filtry z linka są zniszczone dlatego, że ktoś nie włożył filtra cieplnego pomiędzy kolektor a filtry i je popalił.

Edit: Co do światła, FL wzbudza się ściśle określoną wiązką światła, często UV lub IR, których w konwencjonalnych żarówkach jest mniej niż w specjalistycznych. Reszta jest wycinana przez filtry, dlatego halogen, który w BF wypala oczy w FL może dać ledwo widoczną smugę albo i nic.

chyba tyle JohnyM pisal na temat FL w ogolnych dyskusjach", ale moze cos jeszcze umknelo.

[sebba28]

Wielkie dzieki Planapo,o to chodzilo.
Kiedys kupilem kilka filtrow za grosze,co prawda nie wszystkie w dobrym stanie.Z moich kombinacji udalo mi sie tylko cos takiego uzyskac jak na zdjeciu ponizej.Filtr umieszczony na porcie swietlnym dawal UV niebieskie swiatlo,drugi byl pomaranczowy.Do testu uzylem nic ktora swieci pod UV.
5sek,ISO200,obj,5x.stack 5zdj.

[Pickul]

sebba jakie masz światło, jaka moc ?
Wyszło całkiem fajnie

czas naświetlania 5 s ?

[planapo]

rzeczywiscie wyglada to calkiem niezle. (:

[sebba28]

Tak czas naswietlania 5s,Led 3W (zdecydowanie za slaby).Ja nic nie widzialem przez okular (tylko delikatna czerwona mgielke) byc moze dlatego ze moja nasadka tri daje tylko 25% na okulary.Za to aparat duzo wiecej widzial.

[JohnyM]

Ładny efekt obróbki. Fotka też całkiem niczego sobie
Problem okazał się leżeć nie w aparacie, ale w mojej obróbce zdjęć. Okazało się, że mój komputer jakoś dziwnie wyświetla kolory, kabel do monitora jest chyba połamany i wygląda to zupełnie inaczej niż na innych urządzeniach. Tutaj jest RAW:
Jestem bardzo zadowolony z efektu, bo udało się połączyć optycznie DIC z fluorescencją (która niestety nie jest tak wizualnie atrakcyjna jak na ciemnym tle, ale uwidacznia się znacznie więcej). W konstrukcjach z wyższej półki": stosowane są multifotoporty, każdy sprzężony z osobnym filtrem barierowym i osobną kamerą. Światło przebiega przez system lustr diachromatycznych i jest rozszczepiane na określone długości fali. U mnie jest to po prostu bardzo niespecyficzna selekcja filtrów wzbudzających i barierowych. Wciąż brakuje mi jednego filtra do ostatecznego testu. Następna w planach będzie wspomniana wyżej nasadka cztero-kanałowa. B G Y R - nieużywany kanał będzie służył do DIC, trzy pozostałe będą zbierać światło emisyjne.

[JohnyM]

Sukces. Ostatnio znów miałem chwilkę czasu i wziąłem się za dobór odpowiednich filtrów. Okazało się, że nie muszę ciągnąć ich z UK, bo mam takie pod nosem w Opolu. Koszt całkowity do tej pory: 175zł. Filtry mogą posłużyć do wzbudzenia pełnego spektrum. Od 360 (minimalna długość, dla standardowej optyki mikroskopowej, można też na krótszej ale trzeba by kupić obiektywy UV) do podczerwieni. Teraz biorę się za następny krok, czyli sklecenie oświetlacza z lampą emitującą UV.


Filtry są bardzo uniwersalne. Działają też na MST z lampką LED z ikei (i jakąkolwiek inną zresztą też). Do poniższych zdjęć użyłem LEDu cree mce cośtam.

[Pickul]

JohnyM dobrze zrozumiałem ?
Przy wzbudzaniu UV nie potrzeba mega silnego źródła światła ?

Poskładałem swoją Epi FL Zeissa. Dokupiłem lamphaus".
Okazało się że Zeiss wypuścił dwa podobne zestawy, W kolorze siwym na halogen 100W i białym na HBO 50W, oczywiście dowiedziałem się o tym po zakupieniu nieodpowiedniego lamhausa. Drobna przeróbka u ślusarza i całość doskonale pasuje.
Światło - 10W zimny LED, zdecydowanie lepiej niż na 3W, ale niestety sukces to nie jest.
Element świecący w diodzie jest niewielki ma ok. 1 cm2, ale składa się z dziewięciu maleńkich pól emitujących światło. Przy ustawieniu optymalnego /najmocniejszego/ oświetlenia widzę 4 pola z dziewięciu /nie wykorzystuje całej mocy leda/. Obraz jest dobrze doświetlony w czterech niewielkich punktach. Lamphaus ma świetny, ruchomy system optyczny, który umożliwia rozproszenie światła i w miarę równomierne wypełnienie pola widzenia ale ze stratą natężenia.
Wniosek - albo znajdę mocną diodę z pojedynczym źródłem światła albo spróbuje z halogenem 100W, albo może coś jeszcze mi do głowy wpadnie.

Przy okazji ma ktoś malutki polaryzator o śr. 17 mm /nie chcę folii/

[JohnyM]

Wysokociśnieniówka jest na pewno dużo skuteczniejsza, ale widziałem już skuteczne wzbudzenie UV zwykłym halogenem. W piątek widziałem takiego zeissa:
micro-shop.zeiss.com/?l=en&=us&f=e&i=10249&h=25&n=0&sd=490950-0006-000

Miał LEDa 360 i jeszcze jakiegoś z dłuższą falą. Całkiem skutecznie dawał sobie radę (w jasnym pomieszczeniu, łatwo widoczna fluorescencja UV w okularach), nie było możliwości równoczesnego oświetlenia DIA i EPI, ale przy dołączonym PH / DIC byłaby już pewnie zbyt słaba.
Spróbuję poszukać, z jakiej mocy LEDów korzysta Zeiss.
Zresztą, Ty tu i tak masz duży atut w postaci solidnych szkiełek planapo i fluor. Przy fluorescencji wysokie Na w połączeniu z jak najmniejszym powiększeniem jest bardzo pożądane. Większa wydajność świetlna.

Co do samych ledów, to wg. mnie nie ma sensu korzystać z mocniejszych niż 5W, bo w rzeczywistości są to kombinacje kilku led na jednym podłożu. A kolektor może efektywnie wykorzystać tylko jeden. Na moim przykładzie:
Mam cree mce 10W z czterema punktami. Przesuwając diodę względem soczewek kolektora:
- albo mam równomiernie wypełniana aperturę jednym z tych punktów i w rzeczywistości wykorzystuję 1/4 mocy tej diody.
- albo mam wszystkie cztery punkty i 100% mocy diody i między nimi mam czarny (nieoświetlony) krzyż. Efekt jest taki, że mam cztery ładnie oświetlone ćwiartki, a środek pola widzenia jest zaciemniony.
- albo mam ustawione światło tak jak powyżej i dorzucam do tego matówkę. Moc matówki aby skutecznie rozbić krzyż jest tak duża, że jasność jest porównywalna jak użycie tylko jednego z punktów.
Jedyna sytuacja, gdzie sprawuje się idealnie, to wtedy gdy dla słabych obiektywów używam pod kondensorem soczewki lassaix.

P.S: folia naprawdę dobrze sobie radzi

[Pickul]

OK, spróbuje z pojedynczym Ledem 5W, podzielę się efektami.
Co do NA to w FL jest naprawdę kolosalna różnica, widzę z moich mizernych jeszcze doświadczeń jak wysokość NA na wpływ na ilość odbieranego światła.
U mnie najlepiej radzą sobie 20/0.75 i 60/1,40. Sprawdzę też setkę mam DPA 100/1.30 UV od Olimpusa.

soczewka lassaix - co to jest ?

[planapo]

np. z CFow UV byly 10/0,5 i 20/0,8, i Fluor 40/1,3. pewnie z czasem zapolujesz (: