metoda kolumienkowa-izolacja RNA

[studumk]

Tak jak w temacie. Wie ktos cos na temat tej metody, jakie odczynniki sie stosuje i moze ktos ma opis procedury. Nie moge nic w necie znlezc na ten temat.
I czym ta metoda rozni sie od metody Chomczynskiego i Sacchi oprocz jak sie spodziewam innych odczynnikow i procedury

[Jakusz]

Jeśli chodzi Ci o zestawy komercyjne (kity) to dokładnego składu buforu nie poznasz tzn. np. proporcji mieszanin itp.

Napiszę bardzo, bardzo zgrubnie:
W zestawie znajdują się:
kolumienki, probówki do zbierania przesączy
bufor do lizy komórek (w nim detergent, sole, proteazy),
bufor dzięki któremu następuje związanie RNA ze złożem kolumny
bufor elucyjny

Ogólnie na pewno używa się DNAz i inhibitorów RNAz
Zasada działania metody to specyficzne oddziaływanie RNA ze złożem w kolumnie. Bufory wraz z zawartością przesącza się przez złoże dzięki wirowaniu w ultrawirówce.

W razie dokładniejszych informacji, pytaj szczegółowiej. Opisy metody można znaleźć w Internecie, szczególnie często anglojęzyczne.

[studumk]

ok dzieki bardzo. znalazlam jakis opis procedury.mam nadzieje ze wystarczy

[Jakusz]

Może zamieść opis lub jego link tutaj. Spróbuje Ci powiedzieć na ile jest to standardowy sposób izolacji. W razie pytań i niejasności - pisz.

Twoje pytanie jest dość rozległe, bo zależy czasem od zestawu i paru innych rzeczy dlatego trudno bardzo ściśle na nie odpowiedzieć, ale gdybyś zadał szczegółowsze pytania np. co dokładnie do czego służy - spróbuje odpowiedzieć.

[helicobacter]

Jestem ciekawy czy ktoś dysponuje metodykami izolacji - oczyszczania RNA jeszcze z przed tej epoki wadliwych kolumn

M.in. wata szklana, 2-3 odczynniki i efekt jakościowy porównywalny z kitami, a efekt ekonomiczny nieporównywalnie korzystniejszy.
(ps. należy pogrzebać w publikacjach od lat 70 do początku poprzedniego 10-lecia- z oczywistych powodów. Oczywiście trzeba posiadać jeszcze umysł poznawczy, odróżniający aktualnych naukowców topornie, robotycznie używających kitów jako super potęgi. ale w 21-wieku. o czym tu mówić).

[pawlinson]

Dla drozdzy i prawdopodobnie innych grzybow to tzw hot phenol.

Kwasny fenol (pH=4.3-5.5 zdaje sie mozna samemu przygotowac nasycajac buforem octanowym NaOAc/CH3COOH). Ja robie dla 10-20 ml hodowli OD600=0.4-0.6. Komorki zbieram na szybkim spinie (ok 4000xg, nie wiem dokladnie - liczy sie pellet) ok minuty (short spin) i dobrze odsaczam pozywke - najczesciej konczy sie wylewaniem pozywki i kolejnym krotkim spinem zeby zebrac resztki ze scianek. Pelet zawieszam w 1ml ddH2O i przenosze do eppendorfki, kolejny short spin (ok 16000xg) 30sec, dokladnie usuwam wode, flash freeze w cieklym azocie. Pozniej osad zawieszam w buforze TES - 200ul (1%SDS, 10mM EDTA, 20mM Tris pH=7.5) i dodaje 400ul fenolu. Inkubacja w termomixerze z maxymalnym wytrzasaniem w 65C do godziny. Przed wirowaniem dodaje 100ul chloroformu (pozwala rozdzielic fazy lepiej i umozliwia zebranie tych 200ul), vortex i spin na top speed w wirowce (moze byc 16kxg jak wyciaga) zeby sie ulozyly fazy (zazwyczaj 5min). Zbieram gorna faze i jesli zalezy mi na super jakosci to jeszcze raz w fenol - 400ul i 10min w 65C (mozna nawet 3 raz). Po fenolowaniu czas na sam chloroform - 200ul do 200ul chloroformu, vortex i spin na top speed do rozdzielenia faz powtarzam min 2 razy (usuniecie fenolu i resztek bialek). Teraz maximum uwagi - dodaje LiCl do koncowego 1M i pozniej 3 objetosci 99.9% etanolu. Mozna zostawic na noc w -20 albo wstawic w suchy lod na 10-15 min. Precypitat i tak powinien byc widoczny po ok 10min nawet w RT. Spin w 4C na max speed przez 30min. Jak zalezy mi na czystosci to 3X wash 70% EtOH, vortexuje do oderwania pelletu (czasem ciezko, jak sie nie da to trudno) i spin 10min, top speed, 4C. Etanol znad osadu zbieram pompka i zostawiam otwarta probowke do osuszenia resztek etanolu. NIE POLECAM SPEED VACA! sa problemy z zawieszeniem i sie traci na jakosci!(ja tak mialem jakby sie ktos czepial) Zawieszam w 50-80ul nuclease free H2O (Ambion). Jesli poprawnie zrobione to po kilku pipetowaniach RNA jest ladnie rozpuszczone i zwieszone a woda jest gest jak np 85% glycerol, robi babelki itp. Zazwyczaj dostaje stezenie ok 3-4ug/ul przy calkowitym plonie 160-500ug. Nic specjalnego ale uwaga - jakosciowo doskonale, nadaje sie do wszystkich aplikacji z RNA (moze byc konieczne wiecej plukania 70% EtOH, bo chyba translacja in vitro nie lubi Cl- ) i wolne od DNA (testowane qPCR wlasciwie uzywalem tego do qPCRow). Na zelu agarozywm bedzie smearowate miedzy 1szym i srodkowym prazkiem - mRNA. Widoczne powinny byc 3 prazki i to bardzo wyraznie, dolny nie ma sladu smearow. RNA jest wolne od tRNA i byc moze malych RNA (miRNA itp), a to za sprawa chlorku litu. Jesli sa problemy z precypitacja lub spodziewana ilosc jest niewielka zastosuj 1ug/ul glikogen (RNase free).
Przypominam ze do pracy z RNA stosowac rekawiczki i czyste odczynniki (DEPC treated, nuclease free), szczegolnie po precypitacji (fenol raczej zabije RNazy). NIE KICHAC, PLUC, SLINIC SIE itp - slina ma takie kozackie RNazy ze zniszcza wszystko (napewno moja, sprawdzalem). Ribonucleotide vanadyl complex (RVC) niby ma byc inhibotorem RNaz jednak nie dziala na sline, przy tym w podwyzszonej temp (65C) powoduje degradacje RNA przy stezeniu 4mM (nie wiem jak inne bo nie sprawdzalem).
W podobny sposob mozna wyciagac RNA ze wszystkiego.

[pawlinson]

A teraz mi sie przypomnialo - jak ktos rzuci argument ze to zmudne i ze kolumienki sa szybsze to raz zrobilem caly protokol w 30min od momentu peletu komorek do zawieszonego RNA. Jakosc byla ogolnie dobra - nie bylo degradacji, 260/280=1.7-1.9. Nie uzywam kitow do RNA bo w drozdzach to strata czasu i szkoda pieniedzy. Wole kupic kilka odczynnikow zamiast kitu ktory czesto jest do kitu, bo jak mam doczyszczac RNA do konkretnych aplikacji to wole oszczedzic kase i zrobic recznie.