Czy ktos rozumie proces wklonowywania DNA do wektora?

[ivelcia]

Witam. Czy ktoś rozumie ten proces i byłby w stanie go wytłumaczyć? Potrzebuje go do rozwiązania pewnego bardzo ciekwego zadania:

Twoim zadaniem jest wklonownie określonego fragmentu DNA do wektora ekspresyjnego.W laboratorium SA dostępne 3 enzymy restrykcyjne: Eco RI,Bam HI, Hind III. Miejsce wielokrotnego klonowania MCS wektora ekspresyjnego zawiera miejsca ciec dla Not I, Xma I, Bam HI i Sac I. Fragment który chcesz wstawic do wektora nie zawiera miejsca ciecia dla zadnego z wymienionych enzymow restrykcyjnych.Opisz w jakis sposób wykonasz zadanie i jak sprawdzisz czy wstawka wklonowala się we właściwej orientacji.

Nie mam pojęcia jak się za to zabrać. Czy ma ktos jakis pomysł? Z góry dzięki.

[macio89]

Witam, pewnie już za poźno ale ja bum zrobił tak:
1) namnożyć wstawkę PCRem - startery do interesującego nas odcinka + overhangi 5 zawierające sekwencje rozpoznawaną przez BamHI GGATCC (ten enzym bo mamy go w labie + mam miejsce cięcia w MCS na wektorze)
2) trawienie produktu PCR BamHI - powstają nam lepkie końce 5´ - GATC
3) trawienie wektora BamHI
4) ligacja wstawki i wektora

oczywiście każdą reakcje sprawdzamy na żelu (kontrole!)

5) prawidłowa orientacja wstawki - analiza in silico w programie np. clone. Wybieramy enzym mający niesymetryczne miejsce cięcia w obrębie wstawki, a drugie gdzieś a wektorze i porównujemy wielkość produktów na żelu

[ivelcia]

Lepiej późno niż wcale dlatego serdeczne dzięki za odpowiedź:)