żółte w żelu SDS i kolumnie Ni-IDA, czy to Nikiel się wymywa

Specjalistyczne forum biotechnologiczne. Metody biotechnologiczne: real-time PCR, western-blot, dot-blot, barwienie, chromatografia, dializa. Zakup, stosowanie odczynników: enzymy restrykcyjne, polimerazy DNA, drabinki i markery białkowe, kwasy nukleinowe, primery do sekwencjonowania, pożywki bakteryjne... Aparatura laboratoryjna, badawcza.
sylwik
Posty: 3
Rejestracja: 6 lut 2014, o 16:41

żółte w żelu SDS i kolumnie Ni-IDA, czy to Nikiel się wymywa

Post autor: sylwik » 20 mar 2015, o 23:09

Co to jest to żółte na żelu SDS, wymywa mi się z kolumny, barwi frakcje. Może jakiś biotechnolog mnie czyta i mógłby odpowiedzieć. Czy kolumna jest przeładowana i to wymywa się nikiel? Czy to tylko z przeładowania, czy przez EDTA z buforu do dializy? Ale EDTA było mało, 0.5mM. Help

Robiłam dializę mojego białka COMT z proteazą TEV, żeby odciąć His-Tag. To po odcięciu powinno się wymywać we flow through (faza ruchoma), a nie odcięte i proteaza zostaje w kolumnie i wymywa się po użyciu buforu z imidazolem. Proteaza widoczna na drugim żelu od E7 do E14, to pod spodem to moje białko, nie wiem co to jest to na górze - E6 - E9.

Dialysis buffer:
50mM Tris-HCl, pH=8, 0.5mM EDTA, 1mM DTT - 3h15min in room temp., 22.5h in cold room
Equilibration buffer:
50mM Tris-HCl, pH=8, 150mM NaCl, 10% glycerol
Ni-IDA, capacity: 10-15 mg protein/mL of resin 10mL column
Column color changed after sample application. Colour went down during elution.
Elution buffer:
50mM Tris-HCl, pH=8, 150mM NaCl, 10% glycerol, 250mM imidazole
Załączniki
laboratorium.jpg
laboratorium-1.jpg
laboratorium-2.jpg
laboratorium-3.jpg
laboratorium-4.jpg

jedis
Posty: 5
Rejestracja: 22 mar 2015, o 14:40

Re: żółte w żelu SDS i kolumnie Ni-IDA, czy to Nikiel się wy

Post autor: jedis » 22 mar 2015, o 15:18

na kolumnie to nie wiem, ale jeśli chodzi o żel i te linie na dole to u mnie robi się dokładnie to samo. nie sprawdzalas buforu próbkowego? kiedy u nas w labie kolega zrobił na troszkę innych proporcjach właśnie takie linie zaczęły się pojawiać pod koniec elektroforezy

ODPOWIEDZ
  • Podobne tematy
    Odpowiedzi
    Odsłony
    Ostatni post