Aktywność enzymatyczna

[GodLike]

mam takie pytanie - czy aktywnosci enzymatyczne roztworow enzymu sie sumuja?

przykladowo: mam dwie probowki z roztworami kwasnej fosfatazy w jednej atywnosc wynosi 1,22 J/ml, a w drugiej 1,18 J/ml - czy aktywnosc enzymu po polaczeniu tych dwoch roztworow wyniesie 2,4 J/ml?

[Jakusz]

Hmmm dobre pytanie. Jestem z tego tematu dosyć na bieżąco, ale nie pojawił się moich rozważaniach taki problem. Moim zdaniem nie są addytywne bo ilość jednostek enzymów dotyczy konkretnego enzymu, więc jest ona inna dla każdego enzymu. Na podstawie ilości jednostek można porównać aktywność różnych enzymów. Ale pewności, że mam rację nie mam. Nie mogę nigdzie znaleźć informacji o addytywności tych wielkości.

[Matthiola]

ale tu chodzi o jeden enzym i dwie aktywnosci. Wydaje mi sie ze nie mozna dodawac a jedynie usrednic, bo za aktywnosc odpowiada ilosc centrow aktywnych i stezenie substratu [przy reakcjach pierwszego stopnia]. Inna cecha zmianiajaca aktywnosc sa inhibitory. Jesli zmieszasz roztwory to nie tylko enzymy ale byc moze i ich inhobotory.
Nie mam precyzyjnej odpowiedzi ale idac tym tokiem myslenia mozna dojsc do wniosku ze aktywnosc sie usredni lub bedzie na poziomie aktywnosci wyzszej. Na chlopaski rozum nie moze sie sumowac.

[Jakusz]

ale tu chodzi o jeden enzym i dwie aktywnosci.

Aa. pominąłem ten fakt. To rzeczywiście jest tak jak pisze Matthiola. Aktywność zależy od warunków, jeśli warunki się zmieniły to i aktywność jest inna. Różnica w wyniku może być błędem, może zależeć od bufora i ilości dodanej itp. Pewne jest jedno nie zależy ona od stężenia enzymu w przypadku nadmiaru substratu (tj. pełnego wysycenia wszystkich dostępnych centrów aktywnych).

[ Dodano: Sro Paź 22, 2008 18:29 ]
Napisz jakie miałaś warunki w tym doświadczeniu i składniki roztworu w którym była fosfataza.

[GodLike]

substratu nie bylo w zadnej z prob, aktywnosc byla oznaczana na podstawie 100 mikrolitrow pobranych z kazdej proby wobec nadmiaru pNPP (substratu) i przeliczona na mililitr roztworu wyjsciowego. bufor byl identyczny dla obu prob (0,2 M tris-hcl), i wszystkie inne warunki rowniez, poniewaz proby sa po prostu kolejnymi frakcjami chromatografii.

a jezeli za aktywnosc odpowiada ilosc centrow aktywnych to po zmieszaniu roztworow ilosc centrow (czyli czasteczek enzymu) powinna dac sie sumowac chyba (?)

nie potrafie tego ugryzc / a proby zostaly juz niestety wylane i nie moge okreslic aktywnosci dla polaczonych frakcji. na nastepnych cwiczeniach bede musial zapytac prowadzacej i wszystko sie wyjasni )

[Savok]

1. Jestes pewien ze te wartosci powinny byc w dzulach na ml? Aktywnosc enzymatyczna zazwyczaj podaje sie w umol/min (jednostki enzymatyczne) lub jednostkach aktywnosci wlasciwej (umol/min*mg). Nie spotkalem sie wczesniej z podawaniem jednostek enzymatycznych w dzulach (czego? ATP).

2. Aktywnosci nie sumuja sie, tylko usredniaja. Tak samo jak stezenia (sa to wartosci analogiczne). Jesli masz 50ml roztworu 0,5M i 50ml roztworu 5M, po polaczeniu jakie bedziesz mial stezenie? 5,5M? Watpie. Z jednostkami enzymatycznymi jest tak samo. Zlewajac 2 roztwory razem zmieniasz warunki (objetosc) tym samym zmniejszasz stezenie enzymu, wiec ilosc jednostek jest mniejsza. Stezenia jednostek podaje sie w u/ml.

3. Logicznym jest, ze aby obliczyc aktywnosc enzymatyczna dodajesz do mieszaniny reakcyjnej znana ilosc enzymu i substrat (pNpp - wiesz jak dziala? bez tego nie mamy o czym rozmawiac) w znanym stezeniu, aby obliczyc ilosc obrotow enzymu, a z tego jego aktywnosc. Zadaj jasno pytanie, ktorego nie mozesz rozgryzc, bo nie wiem co Ci dalej podpowiedziec.

[GodLike]

1. J to nie dżul, tylko spolszczony zapis standardowej jednostki enzymatycznej U [umol/min]

3.

aby obliczyc aktywnosc enzymatyczna dodajesz do mieszaniny reakcyjnej znana ilosc enzymu i substrat

w jaki sposob chcesz poznac ilosc enzymu w oczyszczanym preparacie, zanieczyszonym innymi bialkami? A280 odpada. jedynym sposobem okreslenia ilosci enzymu w probie jest wyznaczenie jego aktywnosci np. poprzez przeprowadzenie katalizy pNPP, odczytanie A410 i porowanie wartosci absorpcji z krzywa standardowa

2. i wlasnie o to mi chodzilo ) jezeli aktywnosci sie nie sumuja, a usredniaja to sprawa jest zamknieta

[Savok]

w jaki sposob chcesz poznac ilosc enzymu w oczyszczanym preparacie, zanieczyszonym innymi bialkami?

Wtedy stosujesz jednostki aktywnosci wlasciwej czyli

umol/min*mg

(umol przerobionego substratu na minute na calkowita ilosc dodanego bialka policzona np metoda Bradford).

J to nie dżul, tylko spolszczony zapis standardowej jednostki enzymatycznej U [umol/min]

Komunikujac sie z ludzmi spoza waskiego srodowiska wlasnej uczelni/wydzialu/katedry sugeruje uzywac nomenklatury standardowej, J to dzul w ukladzie SI, U to jednostka enzymatyczna, odstepstw nie ma.

[Jakusz]

Logicznym jest, ze aby obliczyc aktywnosc enzymatyczna dodajesz do mieszaniny reakcyjnej znana ilosc enzymu i substrat

A nie da się określić aktywności bez znanej ilości enzymu, a jedynie przy znajomości ilości dodanego substratu i badaniu spektrofotometrycznie stężenia powstającego produktu?

[Savok]

A nie da się określić aktywności bez znanej ilości enzymu, a jedynie przy znajomości ilości dodanego substratu i badaniu spektrofotometrycznie stężenia powstającego produktu?

Nie, musisz miec jakis przelicznik na enzym. Moze byc to calkowite stezenie bialka jakie bylo w mieszaninie reakcyjnej jesli nie znasz stezenia enzymu, ale cos byc musi.

[yeast]

a jezeli za aktywnosc odpowiada ilosc centrow aktywnych to po zmieszaniu roztworow ilosc centrow (czyli czasteczek enzymu) powinna dac sie sumowac chyba (?)

Różne enzymy mają różne powinowactwo do substratu więc to nie ejst takie proste.

[Jakusz]

Nie, musisz miec jakis przelicznik na enzym. Moze byc to calkowite stezenie bialka jakie bylo w mieszaninie reakcyjnej jesli nie znasz stezenia enzymu, ale cos byc musi.

Cały czas mi coś nie pasuje. Na ostatnich ćwiczeniach robiłem oznaczanie zawartości kwaśnej fosfatazy w homogenacie kiełków pszenicy. Podczas doświadczeń, w żadnym momencie nie potrzebowałem ilości dodawanego enzymu a byłem w stanie na koniec wypluć wynik będący aktywnością enzymu.

Jedyne co potrzebowałem to zrobić wykres szybkości reakcji do ilości dodanego homogenatu (w ml), przy czym dalej nie znałem nominalnego stężenia dodawanego enzymu, a jedynie µmol/min przerabianego substratu. Tą ostatnią wartość wyznaczyłem z krzywej kalibracyjnej dla produktu. I tyle - z wykresu szybkości do ml homogenatu można było ocenić ilość jednostek enzymu w ml homogenatu czyli aktywność molekularną (tj. liczbę obrotów). Stężenie enzymu dalej wydaje mi się zagadką.

Jeśli coś pomieszałem, to mnie poprawcie. Mogłem jakiś istotny szczegół zaniedbać

[ Dodano: Nie Paź 26, 2008 11:57 ]
Wróć! To nie była ilość obrotów tylko po prostu ilość jednostek w mililitrze homogenatu.

[Savok]

Moze byc to calkowite stezenie bialka

do ml homogenatu

Widzisz pewna analogie?