PCR problem

Specjalistyczne forum biotechnologiczne. Metody biotechnologiczne: real-time PCR, western-blot, dot-blot, barwienie, chromatografia, dializa. Zakup, stosowanie odczynników: enzymy restrykcyjne, polimerazy DNA, drabinki i markery białkowe, kwasy nukleinowe, primery do sekwencjonowania, pożywki bakteryjne... Aparatura laboratoryjna, badawcza.
Oluniaaaa
Posty: 1
Rejestracja: 23 sie 2013, o 23:53

PCR problem

Post autor: Oluniaaaa » 23 sie 2013, o 23:58

Witam,

Przeprowadzam amplifikację genu ok 5 tys par zasad.
Matryca ma wprowadzone około 13 mutacji celowych. PCR działa ale tylko za 1 razemkiedy próbuję użyć jako matrycy materiału uzyskanego w 1 PCR po uprzednim oczyszczeniuPCR nie działa. Używam tych samych priemrów, te same warunki, ta sama objętość i ilosć poszczególnych składników. Co może byc problemem?

labrat2
Posty: 1
Rejestracja: 25 sie 2013, o 14:50

Re: PCR problem

Post autor: labrat2 » 25 sie 2013, o 14:57

Uzywanie produktu PCR jako matrycy w 2 PCR na tych samych primerach czesto nie dziala. Szczerze mowiac nie wiem czmu, do te pory jedynie raz udalo mi sie wydajnie amplifikowac produkt w ten sposob. Najlepiej sprobuj zrobic nested PCR, czyli potrzebujesz drugiej pary primerow ktore beda amplifikowac nieco wiekszy produkt i wtedy uzyj go jako matrycy do 2 rekcji. To powinno dzialac swietnie. Znaczenie moze miec tez ilosc produktu PCR uzyta jako matryca, pamietaj zeby nie przesadzic z iloscia. Pare ng to w zupelnosci wystarczy. Z wlasnego doswiadczenia wiem, ze zamowienie nowej pary starterow amplifikujacych wiekszy produkt (o np 50bp z kazdej strony) oszczedza czas i pieniadze (zrobisz to raz i bedzie dzialac, zamiast probowac n razy bez powodzenia.). Domyslam sie, ze klopotem jest mala ilosc produktu PCR na pierwszym etapie. Upewnij sie, ze program jest odpowiedni np. czas elongacji (regula kciuka - 1min/1kb). Mozesz tez ostatecznie sprobowac touch-down PCR, stosowalismy go z powodzeniem i czesto efekt byl zaskakujacy - bylo widac produkt PCR jako czerwony prazek golym okiem po rozdziale w zelu agarozowym z barwnikiem.
Powodzenia

ODPOWIEDZ
  • Podobne tematy
    Odpowiedzi
    Odsłony
    Ostatni post